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剧情介绍

【论著】基金项目:中国博士后科学基金特别资助项目(200902355);中国博士后科学基金面上资助项目(20080440816);广西教育厅科研立项项目(200911LX38)作者简介:农清清(1971-),女,副教授,博士后,从事环境毒理学研究。微囊藻毒素-LR 对人肝癌HT17细胞周期及细胞凋亡的影响农清清1,2,Takeuchi T 3,Komatsu M 3,张志勇1,何敏11.广西医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学教研室,广西南宁530021;2.广西医科大学博士后科研流动站;3.日本鹿儿岛大学医齿学综合研究科环境医学研究室摘要:目的研究微囊藻毒素-LR (MC -LR )对人肝癌HT17细胞周期、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法调整HT17细胞密度为1×104/孔,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO )、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0μmol/L 的MC-LR 染毒组和去铁敏(DFO ,1mmol/L )染毒组以及MC-LR (0.8μmol/L )+DFO (1mmol/L )染毒组培养24h ,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT )法检测细胞生长情况。调整HT17细胞密度为1×105/孔,分别设终浓度为0(溶剂对照)、MC-LR (0.8μmol/L )染毒组和DFO (1mmol/L )染毒组以及DFO (1mmol/L )+MC-LR (0.8μmol/L )染毒组培养24、48h ,采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果高剂量(≥0.8μmol/L )MC-LR 染毒24h 后细胞存活率明显低于溶剂对照组(P <0.01),DFO+MC-LR 染毒组细胞存活率高于0.8μmol/L MC-LR 染毒组(P <0.05)。与溶剂对照组相比,MC-LR 染毒24、48h 后G 0/G 1期细胞所占比例和细胞凋亡率均增高,S 期细胞所占比例下降(P <0.05或P <0.01);DFO+MC-LR 染毒组与MC-LR 染毒组染毒24h 后各期细胞所占比例无差异(P >0.05)。DFO+MC-LR 染毒组染毒24h 后细胞凋亡率低于MC-LR 染毒组(P <0.01)。结论MC-LR 可导致HT17细胞在G 0/G 1期发生阻滞及细胞凋亡,可能与其诱发的氧化应激、蛋白质磷酸化状态紊乱有关。关键词:微囊藻毒素-LR ;细胞周期;细胞凋亡中图分类号:R994.6文献标志码:A文章编号:1001-5914(2011)06-0496-03Effects of MC -LR on Cell Cycle and Cell Apoptosis in Human Hepatoma HT17Cells NONG Qing -qing ,Takeuchi T ,Komatsu M ,et al .Department of Occupational and Environmental Health ,School of Public Health ,Guangxi MedicalUniversity ,Nanning ,Guangxi 530021,China Abstract :Objective To explore the effects of microcystin-LR (MC-LR )on cell cycle and cell apoptosis.Methods Humanhepatoma cell lines HT17were cultured at a density of 1×104cells/well.The cells were treated with solvent (0.1%DMSO),MC-LR (0.05-5.0μmol/L ),deferoxamine (DFO ,1mmol/L)or MC-LR (0.8μmol/L)in the presence of DFO (1mmol/L)for 24h ,then thegrowth of cells was evaluated by MTT assay.HT17cells (1×105/well)were treated with solvent (0.1%DMSO),MC-LR (0.05-5.0μmol/L ),DFO (1mmol/L)or 0.8μmol/L MC-LR in the presence of DFO (1mmol/L)for 24or 48h.Flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.Results After exposure to 0.8μmol/L and higher concentrations of MC -LR for 24h ,the cell viability in MC-LR-treated group was significantly lower than that of solvent control group (P <0.01).The cell viability in the group that received combined treatment with DFO and MC-LR (combined treatment group)was significantly higher than that of 0.8μmol/L MC -LR -treated group (P <0.05).Compared with solvent control group ,the percentage of cells in G 0/G 1phase and apoptosis significantly increased ,and the cells in S phase decreased after exposure to MC-LR for 24and 48h (P <0.05or P <0.01).No significant difference in the percentage of cells in different phases was observed between combined treatment group and MC-LR-treated group.The percentage of apoptosis in combined treatment group was significantly lower than that of MC-LR-treated group (P <0.01).Conclusion MC-LR can induce cell cycle arrest at G 0/G 1phase and increase cell apoptosis ,in which oxidative stress and perturbation in protein phosphorylation may be concerned.Key words :Microcystin-LR ;Cell cycle ;Cell apoptosis 微囊藻毒素(Microcystins ,MC )是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻等产生的一组具有肝脏毒性的单环多肽毒素。迄今为止,已发现MC 有80多种异构体[1,2]。在众多异构体中,存在最为普遍,含量较多,毒性较大的是微囊藻毒素-LR (microcystin-LR ,MC-LR )。MC-LR 作用的主要靶器官为肝脏,大剂量急性暴露会引起肝脏的急性中毒,使肝细胞肿胀、浓缩和坏死,肝脏大面积出血,甚至死亡[1]。很多研究表明,MC-LR 可导致氧化应激、DNA 损伤、细胞骨架崩解,从而产生毒性作用[3-5]。但迄今为止,MC-LR 的细胞毒性作用机制尚未完全阐明。本实验拟用不同剂量MC-LR 对人肝癌HT17细胞株进行染毒,观察MC-LR 对HT17细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的影响以及抗氧化剂去铁敏(deferoxamine ,DFO )对此过程的干预作用,以进一步探讨MC-LR 的毒性作用机制。1材料与方法1.1细胞株、主要仪器与试剂人肝癌HT17细胞株由日本东北大学老年医学研究所细胞资源中心惠赠。CKX41型倒置显微镜(日本Olympus 公司),CO 2培养箱(美国Thermo 公司),MPR-A4i 型酶标仪(日本Tosoh 公司),FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)。MC-LR(纯度>98%,瑞士Alexis公司),0.1%二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),青霉素和链霉素(美国Gibco-BRL 公司),四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,日本同仁化学研究所),伊格尔最低必需培养基(MEM)、胎牛血清、DFO、溴化乙啶(PI)均购自美国Sigma公司。MC-LR染毒溶液的配制:取适量的MC-LR,用0.1%二甲基亚砜溶解,临用时现配。DFO染毒溶液的配制:取适量的DFO,溶解于水中,得到浓度为10mmol/L的DFO溶液。1.2细胞培养将HT17细胞置于MEM培养基(含10%加热失活胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)中,于37℃,5%CO2和95%O2条件下培养。每3d换液,传代培养1次或收获细胞。1.3检测细胞活性的MTT试验参照Komatsu等[6]的方法进行MTT试验。调整HT17细胞密度为1×104/孔接种于96孔板,培养24h后,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO)、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0μmol/L的MC-LR染毒组和DFO(1 mmol/L)染毒组以及MC-LR(0.8μmol/L)+DFO(1mmol/L)染毒组,每组设3个平行孔。继续培养24h后,每孔加50μl MTT溶液,37℃孵育3h,弃去培养液,加入100μ1的DMSO,室温下摇床振荡5min后,用酶标仪测定570nm波长处的吸光度(A)值。并计算细胞存活率(细胞存活率=A染毒组/A溶剂对照组×100%)。1.4细胞周期和细胞凋亡的流式细胞术检测参照文献[7],取对数生长期的HT17细胞,以1×105/孔接种于6孔板,培养24h 后,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO)、MC-LR(0.8μmol/L)染毒组和DFO(1mmol/L)染毒组以及DFO(1mmol/L)+ MC-LR(0.8μmol/L)染毒组培养24、48h后,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞,PBS洗涤2次后,用70%乙醇-20℃固定过夜。离心除去固定液,并以PBS洗涤1次,所得细胞用50μg/ml 溴化乙啶(含RNA酶100μg/ml)37℃避光染色30min。用流式细胞仪检测被溴化乙啶染色的细胞,分析DNA含量。每次每个样品检测10000个细胞。由于凋亡细胞的DNA含量低于正常二倍体细胞含量,在二倍体细胞的G /G1峰前出现的一个亚二倍体峰(sub-G1峰)即代表凋亡细胞峰。根据此峰的面积可计算凋亡细胞百分率。使用Cylchred细胞周期分析软件测定细胞周期中G /G1、S和G2/M各期细胞所占的比例以及凋亡细胞百分率[8]。1.5统计学方法所有实验重复做3次。实验数据均以x±s表示。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。率间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MTT试验结果表1可见,MC-LR浓度为0.8~5.0μmol/L 时,细胞存活率明显低于溶剂对照组,差异有统计学意义(P< 0.01);随着MC-LR染毒浓度的升高,HT17细胞存活率呈下降趋势。DFO+MC-LR染毒组细胞存活率高于0.8μmol/L MC-LR 染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.2MC-LR染毒HT17细胞周期的变化表2可见,与溶剂对照组相比,MC-LR染毒24、48h后G /G1期细胞所占比例增高,S期细胞所占比例下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P< 0.01),而且呈时间-效应关系。DFO+MC-LR染毒组染毒24h后各期细胞所占比例与MC-LR染毒组比较,差异均无统计学意义。2.3MC-LR染毒HT17细胞凋亡的变化表3可见,与溶剂对照组相比,MC-LR染毒24、48h后细胞凋亡率均增高,差异有统计学意义(P<0.01)。DFO+MC-LR染毒组染毒24h后细胞凋亡率低于MC-LR染毒组,差异有统计学意义(P<0.01)。3讨论MC-LR具有较强的肝毒性和促癌活性。有研究表明,MC-LR的毒性效应表现为剂量上的双向性,即低剂量(nmol/L~pmol/ L水平)的MC-LR具有促进细胞增殖以及肿瘤形成的效应,而高剂量(μmol/L水平)的MC-LR则可引起细胞死亡或凋亡[9]。本研究结果显示,0.05~0.4μmol/L的MC-LR染毒HT17细胞24h,未观察到明显的细胞增殖效应或细胞活性抑制效应;而高剂量(≥0.8μmol/L)MC-LR染毒细胞可明显抑制HT17细胞生长。DFO作为一种铁离子的螯合剂,可以阻断Fenton反应中过氧化氢(H2O2)降解为羟自由基(OH-),从而减轻细胞的氧化损伤[10]。本研究发现,DFO可在一定程度上阻断MC-LR对HT17细胞的生长抑制作用,提示除了诱发氧化应激,MC-LR还可能通过其他作用机制抑制细胞生长。笔者采用PI对细胞进行染色后分析细胞周期,以明确MC-LR引起的细胞生长抑制作用是表1MC-LR染毒对人肝癌HT17细胞活性的影响MC-LR(μmol/L) 0.050.10.20.40.82.05.0 0.8DFO(mmol/L)0.00.00.00.00.00.00.00.01.01.0细胞存活率100.21±1.21101.29±9.1299.48±4.5099.22±2.0996.59±6.5877.04±2.49a66.70±3.82a50.12±3.98a99.71±3.0890.77±2.06b(n=3,x±s,%)注:a与溶剂对照组比较,P<0.01;b与0.8μmol/L MC-LR染毒组比较,P<0.05。表2MC-LR染毒对HT17细胞周期的影响MC-LR(μmol/L)0.00.80.80.00.8DFO(mmol/L) 11时间(h)242448242449.90±0.8361.75±2.13a73.81±0.56b49.73±0.3459.27±2.4637.68±0.3726.89±2.02a13.67±0.78b38.94±1.6928.27±2.2212.42±1.0811.37±1.6512.54±0.3211.33±1.5912.47±1.63G0/G1期S期G2/M期(n=3,x±s,%)注:与溶剂对照组比较,a P<0.05,b P<0.01。表3MC-LR染毒对HT17细胞凋亡的影响MC-LR(μmol/L) 0.80.8 0.8DFO(mmol/L) 11时间(h)24244824242.65±0.8712.2±0.77a9.98±0.22a2.30±0.587.52±0.65b凋亡率(n=3,x±s,%)注:a与溶剂对照组比较,P<0.01;b与MC-LR染毒24h组比较,P<0.01。天津市北辰区学校生活饮用水卫生学监测徐国和,赵永胜天津市北辰区疾病预防控制中心,天津300400关键词:水;卫生调查;学校中图分类号:R122.2文献标志码:E文章编号:1001-5914(2011)06-0498-01为了解北辰区学校生活饮用水水质卫生状况,于2010年对北辰区30所普通中学、2所职业大学、2所寄宿制小学、36所小学校各采集1份水样。49所学校饮用降氟设备出水(市政供水),15所学校以自备井水为水源,6所学校饮用桶装纯净水。按GB/T 5750—2006《生活饮用水标准检验方法》检测,以GB5749—2006《生活饮用水卫生标准》进行评价。调查显示,88%的学校能够按照《学校卫生工作条例》规定要求,向学生及时提供开水或纯净水,但有12%的学校未向学生提供开水,90.8%学校对学生开展经常性的饮水卫生健康教育。15%的学校自备井没有供水安全卫生制度,没有供水管理员,水源防护工作较差。共检测水样70份(表1),除浑浊度(合格率为94.29%)、菌落总数(合格率为81.43%)、耗氧量(合格率为91.43%)、氟化物(合格率为95.71%)外。其他检测指标均合格。48份水样所有检测指标均合格,合格率为68.57%。其中,市政供水监测49份,合格率为71.43%;自备井水监测15份,合格率为60%;桶装纯净水检测6份,合格4份。4份水样浑浊度超标,均值为10NTU,13份水样菌落总数超标,范围为150~280cfu/ml;6份水样耗氧量超标,均值为5.6mg/L;3份水样氟化物超标,均值为3mg/L。说明部分学校的生活饮用水受到了不同程度的污染,提示广大师生禁止直接饮用生水,学校应重视对生活饮用水的消毒管理。本区的深井水通过降氟器过滤后供给饮用,在监测结果中,15份自备井水样本中,3份样本氟化物结果为3mg/L。提示有关部门应积极开展降氟设备的定期核查和自备井水的监测,确保学校生活饮用水符合国家卫生标准。(收稿日期:2011-01-27修回日期:2011-04-20)(本文编辑:杜宇欣)表1天津市北辰区学校不同类型生活饮用水合格率饮水类型市政供水自备水源桶装纯净水合计样本数(件)4915670浑浊度97.9680.00100.0094.29菌落总数81.6386.6766.6781.43耗氧量91.8486.67100.0091.43氟化物100.0080.00100.0095.71(%)否与细胞周期的改变有关。本研究结果显示,0.8μmol/L MC-LR染毒细胞24h后,细胞周期发生改变,表现为G /G1期细胞所占比例增多,S期细胞所占比例减少,差异均有统计学意义(P< 0.05或P<0.01);表明高剂量的MC-LR可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制细胞的增殖。但DFO与MC-LR联合染毒未能逆转MC-LR引起的细胞周期阻滞。很多研究表明,细胞周期是由周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)以及其他调节CDK磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶所调控[11]。而MC-LR是极强的蛋白磷酸酶抑制剂,能抑制细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PPl和PP2A的活力,从而打破细胞内蛋白磷酸化/脱磷酸化的平衡而产生毒性作用[1]。因此,推测MC-LR可能通过改变这些细胞周期调控蛋白的磷酸化水平,引起细胞周期阻滞。本研究还发现,0.8μmol/L MC-LR染毒细胞24h后,可引起sub-G1峰的细胞明显增多,表明细胞凋亡率增加,而DFO 能明显抑制MC-LR诱导的细胞凋亡。提示MC-LR引起的细胞凋亡可能与其诱导的氧化应激有关,至于MC-LR对氧化应激系统包括活性氧(ROS)产生、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)形成、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化物酶活力的影响及其在MC-LR诱导细胞凋亡中的作用仍有待进一步深入研究。参考文献:[1]Gehringer MM.Microcystin-LR and okadaic acid-induced cellular effects:a dualistic response〔J〕.FEBS Lett,2004,557:1-8.[2]张慧珍,李超锋,张丰泉,等.微囊藻毒素-LR对体外培养大鼠睾丸支持细胞中活性氧及丙二醛含量的影响〔J〕.环境与健康杂志,2010,27(10):866-868.[3]Weng D,Lu Y,Wei Y,et al.The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice〔J〕.Toxicology,2007,232:15-23.[4]Zegura B,Lah TT,Filipic M.The role of reactive oxygen species in microcystin-LR-induced DNA damage〔J〕.Toxicology,2004,200:59-68.[5]Komatsu M,Furukawa T,Ikeda R,et al.Involvement of mitogen-activated protein kinase signaling pathways in microcystin-LR-induced apoptosis after its selective uptake mediated by OATP1B1and OATP1B3〔J〕.Toxicol Sci,2007,97:407-416.[6]Komatsu M,Sumizawa T,Mutoh M,et al.Copper-transporting P-type adenosine triphosphatase(ATP7B)is associated with cisplatin resistance〔J〕.Cancer Res,2000,60:1312-1316.[7]Kitazono M,Takebayashi Y,Ishitsuka K,et al.Prevention of hypoxia-induced apoptosis by the angiogenic factor thymidine phosphorylase 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1998,253:797-803.[8]Khan N,Afaq F,Syed DN,et al.Fisetin,a novel dietary flavonoid,causes apoptosis and cell cycle arrest in human prostate cancer LNCaP cells〔J〕.Carcinogenesis,2008,29:1049-1056.[9]帅怡,王彦琴,尹建勋,等.MTT法观察微囊藻毒素-LR对原代大鼠肝细胞的双向毒性作用〔J〕.现代预防医学,2010,37(12):2289-2291.[10]Al-Ghamdi SS,Chatterjee PK,Raftery MJ,et al.Role of cytochrome P4502E1activation in proximal 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