乌鳢结节病病原-诺卡氏菌的分离与鉴定曹铮1沈锦玉1谢荣林 2 潘晓艺 1 吕伟清2郝贵杰1尹文林1吴颖蕾1(1.浙江省淡水水产研究所, 湖州313001)(2桐乡市水产工作站,嘉兴314500)摘要:2006年4月份起,浙江萧山、桐乡乌鳢养殖出现大量死亡,发病症状为肛门红肿,腹部膨大,有大量腹水,内脏有白色结节点,尤以肾脏为甚,严重的腹腔内出现肿瘤。经罗氏培养基培养从病鱼的肾脏分离到一株细菌SH628。人工感染证实为乌鳢的病原菌,其半数致死量(LD50)为1.7µg/尾鱼。为了进一步确定其分类地位,测定了病原菌的16S rRNA基因部分序列,经PCR扩增获得了菌株大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,并测序,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea) 的16S rRNA具有高99%的同源性,该序列在Genbank 上的登录号为EF025583。结合生理生化特性测定,具此鉴定结果认为该菌为鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea)。药敏试验结果表明该菌对红霉素、环丙沙星等抗生素敏感。关健词:乌鳢;鰤鱼诺卡氏菌;罗氏培养基;16S rRNA基因乌鳢(Ophiocealus argus)又称黑鱼、乌鱼、才鱼,隶属于硬骨鱼、鲈形目、攀鲈亚目、鳢科、鳢属,我国分布于除新疆、西藏外的各大水系,为凶猛的肉食性鱼类,营养、药用和经济价值较高, 肉味鲜美,口感细腻,蛋白质含量高,骨刺少,在医学上具有滋补、活血、收敛等作用,对伤口的愈合有很好的效果。且具有生长快、疾病少、适应性强、产量高等特点, 价格稳定,深受养殖户喜爱,已成为淡水名特优养殖的主导品种之一。浙江省的乌鳢养殖业处于全国领先水平,又以余杭、桐乡、萧山为主产区。随着养殖规模的扩大,各种病害的发生也日益频繁,严重威胁着乌鳢养殖业的健康发展。2006年4月起浙江萧山、桐乡一些养殖户出现了大面积死鱼现象,1每天死亡4-5千斤,给养殖户造成极大的损失。发病症状为肛门红肿,内脏有白色结节点,肾脏为甚。严重的可有肿瘤出现。用中文TSA和罗氏培养基分离培养细菌,其中48小时左右在罗氏培养基中分离到SH628菌,本研究主要通过16S rRNA基因序列测序,鉴定了乌鳢SH628菌是病原菌,为鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea) [1],为淡水鱼类诺卡氏菌病原的分离鉴定研究打下了基础。在桐乡的患病乌鳢中分离到了同样的鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea)。水产动物中首例报道诺卡氏菌病的是虹彩脂鱼(Hyphessobrycon innesi)[2],以后在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[3]、黄尾鰤(Seriola quinqueradiata)[1]、红鲑(Oncorhynchus nerka)[4]等水产动物中分离到诺卡氏菌。国内首例报道是大黄鱼[5](Larimichthys crocea)感染鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea) [1],淡水鱼中台湾陈石柱[6]有报道乌鳢(Ophiocealu sargus)感染星状诺卡氏菌(Nocarkia asteroids) [2、3]。1 材料与方法1.1 实验材料患病乌鳢来自浙江萧山某黑鱼养殖场,典型发病鱼侧游于池塘边缘,肛门红肿,有腹水。解剖后内脏有白色的结节,肾脾尤甚。每天死亡4-5kg,不同的鱼池死亡程度不一样,平均死亡率约30%。健康乌鳢购自浙江湖州无发病史的乌鳢养殖场,平均规格75g,体长22cm饲养于2m3大小水泥池中,实验期间水温维持在28-30℃。1.2 细菌的分离从患病鱼的肝、脾、肾、腹水等组织取样在TSA、罗氏琼脂平板上进行划线分离, 28~30℃培养4-10d,可见黄褐色的菌落。挑取优势菌落分别在含0.5%NaCl的TSA和罗氏琼脂平板上划线分离纯化数次,获得纯培养物。1.3 细菌感染试验由于SH628菌株目前还只能在固体平板上培养,用接种圈刮取少量菌称重,以0.01g加100µl灭菌生理盐水为原液,并将原液稀释10-2、10-3、10-4、10-5,即浓度为1000、100、10、1µg/ml,腹腔注射0.2ml/尾,每组10尾鱼,对照组注射无菌生理盐水,剂量同试验组。饲养水温28~30℃。感染时间25d。1.4 细菌分类鉴定1.41 形态观察1.42 生化鉴定纯培养的细菌经20℃、3-4d平皿培养进行个体形态、菌落形态和培养特征的观察及主要生理生化试验。生理生化特性测定参照弧菌鉴定盒(杭州天和微生物试剂有限公司)、ID 32E及API 20E[法国,生物梅里埃公司(BioMerieux)]生化鉴定条进行。并参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》。1.43 细菌的分子鉴定1.4.3.1 细菌总DNA制备细菌基因组DNA的提取参照文献进行。抽提细菌的基因组DNA在0.8% agarose电泳观察检验,并作为PCR扩增的模板。1.4.3.2 16S rRNA基因的PCR扩增和产物纯化16SrRNA基因PCR扩增方法参照王国良等[6]的方法进行。16SrRNA基因PCR扩增引物分别为:P1:5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`;P2: 5`-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。PCR产物的回收纯化采用上海生工科技公司的DNA快速纯化回收试剂盒。PCR纯化产物直接测序,测序工作由上海英骏生物技术有限公司用3730DNA自动测序仪测序。测序引物分别为P1: 5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`;P2:5`-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。2 结果2.1 病鱼的症状发病鱼症状:鱼侧游于水中,体色较正常鱼深一些,肛门红肿,有时体表会有少量红点出现,腹部明显肿大。解剖后有腹水,肝、脾、肾明显肿大并有白色结节点,严重时腹腔内还出现肿瘤样物质。2.2 细菌形态病原菌普通镜检,菌体呈长或短杆状,可单个、成对、Y或V字状排列,不运动,无孢子。病原菌在TSA培养基上生长缓慢,一般一星期后才能长出,而在罗氏培养基上2天后就能长出,颜色主要为淡褐色,菌落的形态、质地一致,沙粒状,比较干燥。2.3细菌的生理生化特性细菌的生理生化特性见表1。表1 SH628菌株的生理生化性状Tab.1 Biochemical characterizations of the strain SH628生化性状characteristics SH628 鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia eriolea)过氧化氢酶(catalase) + + 氧化酶(oxidase) - - 尿酶(urea) + - 硝酶盐还原(nitrate) + + 水解(decomposition of):七叶灵(aesculin) + + 明胶(gelatin) - - 淀粉(starch) - - 酪素(casein) - - 黄嘌呤(xanthine) - - 酪氨酸(tyrosine) - - 惟一碳原利用(growth on sole carbon sources):甘露醇(mannitol) - - 阿拉伯糖(arabinose) - - 山梨醇(sorbitol) - - 柠檬酸盐(citrate) + + 在45℃下生长(growth at 45℃) - -2.4 细菌感染试验细菌感染试验见表2。表2 SH628菌株对健康乌鳢的感染试验Tab.2 Challenge test of snakehead fish with bacteria SH628菌株strain 死亡时间(天)death time细菌感染浓度bacteria concentration(µg/尾鱼)200 20 2 0.2 对照SH628 13 2 0 0 0 014 1 1 1 0 015 0 1 1 0 016 1 1 0 0 018 0 0 1 0 019 1 1 0 0 0 22 0 1 0 0 0累计死亡总数Accumulated death5 5 3 0 0 死亡率death rate 100% 100% 60% 0% 0% LD50 1.72.5药物敏感试验表3 SH628菌株的药物敏感试验Tab.3 The sensitivity of strain SH628 to antibiotics药名drug抑制效果inhibiting effect药名drug抑制效果inhibiting effect红霉素Erythromycin46S 氯霉素Chloramphenicol10R 环丙沙星Ciprofloxacin34S 新霉素Neomycin12R 罗红霉素Roxithromycin26S卡那霉素Kanamycin22S 阿米卡星Amikacin14R 链霉素Streptomycin sulfate24S 先锋ⅤCefazolin Sodium-R 青霉素G Penicillin G-R 痢特灵Nifurazolidone8R 复方新诺明SMZ+TMP18S 氟哌酸Norfloxacin24S 庆大霉素Gentamicin18S 磺胺嘧啶Sulfadiazine24S 四环素Tetracycline11R注:R指耐药,M指中度敏感,S指高度敏感,-表示无抑菌圈,前面的数字表示抑菌圈的直径,单位为mm。2.6细菌总DNA的分离和PCR 扩增16S rRNA基因从SH628培养细菌中获得总DNA,以总DNA为模板,Pl、P2为引物,PCR扩增到约l500 bp条带,见图1。M 1 ← 图1 PCR 扩增的16S rRNA 产物Fig.1 16S rRNA product by PCR1: product M: maker2.7细菌的16S rRNA 基因鉴定菌株SH628的基因组,以P1、P2为引物,经PCR 扩增获得了预期的1.5Kb 的特异条带,PCR 产物经回收,获得了细菌16S rRNA 基因的部分序列,在GenBank 中登录号为 EF513204。将测定的序列递交NCBI 进行BLAST 同源序列比对,与鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea )的16S rRNA 基因具有较高同源性99%,因此认为SH628菌株属于鰤鱼诺卡氏菌。将SH628株的16S rRNA 基因序列作进化树分析,结果表明SH628株与其它诺卡氏菌分成2个组,其中SH628株成一分支,其余诺卡氏菌成另一分支如图2。但与鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea )(登录号为AB255702)最近。 图2 鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea ) 进化树图分析Fig. 2 phylogenetic tree of Nacardia seriolea 2000 1000750 500 2501001.5kb3讨论浙江省从1995年开始进行乌鳢的人工养殖,在繁殖生物学、苗种培育、池塘养殖技术等方面进行了研究,并获得成功,至2000年形成规模养殖,我省的乌鳢养殖业处于全国领先水平。但乌鳢养殖中对病害发生原因研究的很少,没有明确病原是细菌还是病毒。只是根据发病症状进行报道,如出血病、腹水病等[7]。首次在萧山、桐乡养殖乌鳢中发现了鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea)。诺卡氏菌曾是日本鰤鱼养殖中最主要的病原菌之一,也是大西洋牡蛎养殖的主要病原菌之一。近年来,在我国大黄鱼网箱养殖中也发现了鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea) [5],对大黄鱼的养殖造成了巨大损失。可见诺卡氏菌对鱼类养殖的危害性是巨大的。1989年台湾陈石柱[6]在黑鱼上发现星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids),而这次在乌鳢中发现的是鰤鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea),与台湾的在细菌的种类上有所差异。据了解在浙江省的其它地区如余杭、海宁等均有发生乌鳢鰤鱼诺卡氏菌病,且有慢延发展的趋势。病原发生的原因和流行病规律还不清楚,是不是因为乌鳢的饲料和大黄鱼一样是冰鲜杂鱼之故,有待进一步研究。从细菌的人工感染实验可知,细菌感染健康乌鳢时,每尾鱼注射细菌200µg, 13天时才发病死亡,有的至19天,可见诺卡氏菌病发病病程较长,发病程度不呈急性型,发病前的症状又不明显,一旦发病死亡率较高,因此早期诊断对该病的防治显得较为重要。目前还没有一种液体培养基能使诺卡氏菌生长良好,一定程度上影响了该病的进一步研究。该病的防治是生产上急需解决的。根据药敏实验结果有针对性的选择药物,结合国家允许的渔用药物[9],指导养殖者采用外泼含氯消毒剂或碘制剂等杀灭池水、鱼体表的病原菌,同时将罗红霉素按1‰量伴饵投喂5d,收到了良好的治疗效果。参考文献:[1] Kusuda R , Taki H, Takeuchi T. 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It was confirmed to be the pathogen of the epidemic by challenge test. Its LD50was 1.7µg/fish. The colony morphological, physiological and biochemical characters of SH628 isolate was determined. About 1.5Kb fragments of the isolate was amplified by PCR using general primers of 16s ribosomal DNA. The PCR product was sequenced. The BLAST results of the sequence showed that it has high homology (99%) with respect sequence of Nacardia seriolea.The accession number of 16S rRNA gene sequence is EF025583 on Genbank. The results indicated that SH628 isolate belong to Nacardia seriolea. The test of sensitivities of strain SH628 to antibiotics revealed that the pathogen is sensitive to drugs such as Erythromycin and Ciprofloxacin.Key word: snakehead fish ; Nacardia seriolea ; Lowenstein medium ;16S rRNA
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